一、材料、仪器设备及试剂

(一)材料

      水稻、小麦叶片、幼穗等。

(二)仪器设备

      真空泵,真空干燥器,小烧杯,玻璃瓶塞,其他用具同离体法。

(三)试剂

      (1)亚硝酸钠标准液(同离体法)。

      (2)0.1 mol/L KNO3。

      (3)1%磺胺。

      (4)0.02%萘基乙烯胺(配制方法同离体法)。

      (5)30%三氯乙酸溶液。30g三氯乙酸,水溶后定容至100 mL。

二、实验步骤

(一)标准曲线制作

      同离体法。

(二)酶反应及活性测定

1.取样

      称取作物叶片1.0~2.0g四份,剪成1 em左右的小段,放于小烧杯中,用直径略小于烧杯直径的玻璃瓶塞将材料全部压于杯底,其中- -份作对照，另外三份作酶活性测定用。

2.反应

       先向对照管中加人lmI 304%三氯乙酸，然后各管中都加人9 mL 0.1mol/1.KNO3溶液,混匀后立即放人干燥器中,抽气1 min 再通人空气,再抽真空，反复几次,以排除组织间隙的气体,至叶片完全软化沉人杯底，以便底物溶液进人组织。最后通人氮气密封后,在25℃黑暗中反应0.5 h,再分别向测定管(对照管除外)加人1mL30%三氯乙酸终止酶反应。

3.比色测定

      将各管摇匀静置2 min后,各取2 mL反应液,加入1 mL磺胺和1 mL萘基乙烯胺.摇匀显色15 min后,于4000 r/min下离心5 min,取上清液于540 nm处测其吸光度。根据标准曲线计算出反应液中生成的亚硝态氮总量(ug)。

三、结果计算

      同离体法。

【注意事项】

       (1)硝酸还原酶容易失活,离体法测定时,操作应迅速,并且在4℃下进行。

       (2)取样宜在晴天进行,最好提前一天施用一定量的硝态氮肥.取样部位应一致。

       (3)硝酸盐还原过程应在黑暗中进行,以防亚硝酸盐还原为氨。

       (4)从显色到比色时间要一致,显色时间过长或过短对颜色都有影响。