目的要求

      学习利用分光光度计法测定抗坏血酸含量的原理和方法。

基本原理

      抗坏血酸具有较强还原力,可以把铁离子(Fe3+)还原成亚铁离子(Fe2+),亚铁离子与红菲咯啉(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉,BP)反应形成红色螯合物。此化合物在波长534nm处具有强的吸收峰,且吸光值与反应液中抗坏血酸含量呈正相关。因此，可用比色法来测定抗坏血酸含量。

材料、仪器及试剂

(一)材料

      鲜枣、青椒、山楂、苹果、柑橘、芒果等。

(二)仪器及用具

       离心机、分光光度计研钵、电子天平、容量瓶(50mL、100mL).漏斗、滤纸、研钵、离心管、试管。

(三)试剂

1、50g/L三氯乙酸(TCA )溶液
称取5.0g三氯乙酸(分析纯),用蒸馏水溶解,稀释至100mL。

2、0.4%磷酸-乙醇溶液
量取0.47mL85%磷酸溶液到无水乙醇中,并用无水乙醇稀释至100mL。

3、5g/L BP -乙醇溶液
称取0. 25g BP(纯度>97.0% )加人到无水乙醇中溶解,并用无水乙醇稀释至50mL。

4、0.3g/L FeCl3-乙醇溶液
称取0.03g FeCl3加入到100mL无水乙醇中,摇匀。

5、100μg/mL标准抗坏血酸溶液
称取10.0mg抗坏血酸(应为洁白色，如变为黄色则不能用),用50g/LTCA溶液溶解、定容至100mL,即1mL 溶液含100ug抗坏血酸。现用现配,保存于棕色瓶中,低温冷藏。

实验步骤

(一)制作标准曲线

      取7支试管,编号,按表1加入各种溶液,将混合液置于30℃下反应60min,然后以0号试管混合液为参比,于波长534nm处测定吸光度值。以抗坏血酸质量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线,求得线性回归方程。

(二)提取

      称取10.0g果肉样品置于研钵中,加入20mL50g/LTCA溶液,在冰浴条件下研磨成浆状，转人到100mL容量瓶中,并用50g/L TCA溶液定容至刻度，混合提取10min后,过滤,收集滤液备用。

(三)测定

      取1.0mL样品提取液于试管中,加入1.0mL50g/LTCA溶液，再按制作标准曲线相同的方法,加入其它成分,进行反应、测定。记录反应体系在波长534nm处吸光度值。重复三次。

实验结果与计算

      根据吸光度值，在标准曲线上查出相应的混合液中抗坏血酸质量,按下式计算果蔬组织中抗坏血酸含量。果蔬中抗坏血酸含量以100g样品(鲜重)中含有的抗坏血酸的质量表示,即mg/100g。计算公式:

式中 m'——由标准曲线求得的抗坏血酸的质量,μg;
Vs——滴定时 所用样品提取液体积，mL;
V——样品提取液总体积, mL;
m'——样品质量,g。

注意事项

      利用此法还可以测定果蔬组织中脱氢抗坏血酸和总抗坏血酸的含量。

      测定的原理:利用二硫苏糖醇( DTT)将脱氢抗坏血酸还原成还原型的抗坏血酸,这样可以通过测定抗坏血酸的含量来进行脱氢抗坏血酸的定量分析。

      具体测定方法:取1.0mL样品提取液，加人0.5mL60mmol/LDTT-乙醇溶液,再用Na2HPO4 - NaOH溶液将溶液pH调至7~8,置于室温下10min,使脱氢抗坏血酸还原。然后加入0.5mL 0. 2g/mL三氯乙酸溶液,调节pH至1~2。按测定抗坏血酸相同方法进行测定，计算出总抗坏血酸含量,从中减去样品中原有的还原型抗坏血酸含量,即得脱氢抗坏血酸含量。