茚三酮法是氨基酸测定应用最广泛的方法之一。当茚三酮在微酸性条件下和氨基酸反应时,氨基酸脱氨脱羧氧化生成醛,放出NHs和CO2,同时还原茚三酮与NH3和另一分子茚三酮进一步反应生成二酮茚-二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物,其最大吸光度的波长为570nm,脯氨酸为440nm,在一定的范围内显色深浅与氨基酸含量成正比。

2.仪器设备

    氨基酸自动分析仪。

3.试剂

    1. pH2.20、pH3.28、pH3.90和pH5.26的柠檬酸缓冲液:分别称取19.88g、19.88g、34.66g、34.66g柠檬酸钠,加水溶解,并依次加人16.5mL、12.0mL、16.5mL、6.5mL 36% HCl,各用水定容到1000mL(其中第一种溶液用于样品的处理,而后三种上机用)。

    2.pH5.20LiAc溶液:称取LiOH.H2O168.0g溶解在293.0mL冰醋酸中,用蒸馏水定容到1 000 mL。

    3.溶解有水合茚三酮和还原茚三酮的pH5.20LiAc缓冲液。称取20g水合茚三酮,2g还原茚三酮溶解在750mL二甲基亚砜和250mLpH5.20的LiAc缓冲液中。溶解时将两种溶液混合后,在旋转搅拌器上搅拌1 h,并通人高纯氮气,防止氧化。

    4.10%的磺基水杨酸溶液:10g磺基水杨酸溶解于蒸馏水并定容到100mL。

    5.氨基酸混合标准液(标液)。

4.方法步骤

    1.木质部汁液的获取。

    2.吸取木质部汁液1mL置于5mL的离心管中,快速加人1mL10%的磺基水杨酸溶液混匀,在16G离心机上于15000r•min-1离心10min,取1 mL上清液加1 mL pH2. 20的柠檬酸缓冲液,超滤,滤液用于氨基酸自动分析仪测定。

    3.结果计算

5.注意事项

    1.必须用10%的磺基水杨酸沉淀伤流液中的蛋白质,以免对色谱柱造成污染。

    2.干旱等胁迫使伤流液浓度增大到对照的2-3倍,因此对胁迫处理下的伤流液要相应稀释2-3倍,方可与对照在同一条件下进行分析