蛋白质中赖氨酸(lysine,Lys)的含量是谷物品质的主要指标之一。由于动物及人类不能合成,须从食物中得以补充,为此培育高含量赖氨酸的谷物,对于提高营养价值有重要意义。本文介绍了使用茚三酮显色法来检测谷类作物种子中赖氨酸含量的原理、实验流程以及实验注意事项，欢迎收藏。关于染料结合法（DBL）可以参考《谷类作物种子中赖氨酸含量的测定-染料结合法（DBL）》

一、原理：

     谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的ε-NH2,它与茚三酮(ninhydrin)试剂可发生颜色反应,生成紫红色物质,其颜色与赖氨酸残基的数目成正相关。

     选用碳原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸,配成标准溶液,做出标准曲线,可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量。

二、材料、仪器设备及试剂

(一)材料

    不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎,过100目筛子,收集过筛后的细粉,放人广口瓶内,加人沸程60~90C的石油醚,使其淹过粉面,浸泡8h,不时搅动进行脱脂。然后过滤,并用石油醚淋洗沉淀若干次,弃去滤液。将脱脂玉米粉晾在干净的滤纸上，置阴凉通风处吹干石油醚。收集干粉，置干燥器内,保存备用。

(二)仪器设备

    722型分光光度计，水浴锅,试管,圆头玻璃棒(圆头大小要与试管大小配套)。

(三)试剂

(1)缓冲溶液,称取30g甲酸钠,溶解于约60mL蒸馏水中,加入10mL8%的甲酸,最后加水到100mL。
(2)茚三酮试剂:称取1g茚三酮和1g氯化镉(CdCl2.H20),加入25 mL上述缓冲溶液和75mL乙二醇,室温下放置--天,第二天使用。若出现沉淀,则过滤后使用。该溶液一定 要头一天配制,第二天使用,不宜放置过久，也不能现用现配。
(3)4%和2%无水碳酸钠溶液各50mL。
(4)标准亮氨酸溶液.准确称取25mg亮氨酸,加数滴稀盐酸,待溶解后定容至50mL,该溶液亮氨酸浓度为500:g/mL。

准确吸取上述母液1mL、3mL、5mL、7mL、9mL,分别稀释至25mL,待用。

三、实验步骤

(一)绘制标准曲线

    准确吸取已配好的标准浓度系列的亮氨酸溶液各0.5mL,分别放人5支试管中,每种浓度做三个重复。再取一支试管加入0.5 mL蒸馏水做空白对照。向每支试管中各加人0.5mL的4%碳酸钠溶液和2mL茚三酮试剂(头一天配好的),混匀,在80C恒温水浴上保温30min。取出后，立即放人冷水浴中冷却3min,然后向每管内加人5mL的95%乙醇,摇匀,在分光光度计上500nm波长处进行比色,以空白做对照,读取吸光度。以吸光度值为纵坐标，亮氨酸浓度为横坐标,绘出标准曲线,并求出曲线的斜率。

(二)样品的测定

     准确称取已脱脂的各种玉米种子干粉各25 mL,每个品种做三个重复。放人试管中(试管应预先烘千),加人约300 mg细石英砂(估计数字)和1 mL 2%碳酸钠溶液,用圆头玻棒充分搅拌2 min,注意切勿将试管挤破。将试管放人80心恒温水浴中,提取10min,应常搅动。取出试管,向每管内按顺序加入2nL茚三酮试剂,混匀,放人80C恒温水浴中,保温显色30min,同时以蒸馏水做一空白对照,取出后，立即放人冷水浴中冷却3min,以下步骤与标准曲线做法相同。加完乙醇后进行过滤，用滤液进行比色,读取吸光度。若样品颜色过深，则可取一-定量的滤液用95%乙醇稀释后比色,吸光度的数值以在标准曲线范围内为宜。
    在标准曲线上查出相当的亮氨酸含量。一-般作物的籽粒中,蛋白质含量约为干重的10% ~ 20%,富含蛋白的种子中则为30% ~ 50%。赖氨酸含量约为3~7g/16g氮。

四、结果计算

按下列公式进行计算:

    式中:G为标准曲线上查出的亮氨酸的量,μg/0.5mL;N为样品稀释倍数;w为样品的干重,mg。

注意事项

    (1)样品要粉碎成细粉,称量要精确到0.1mg。

    (2)样品与石英砂要充分研磨提取,每次操作要致。

    (3)茚三酮试剂要头天配制,第二天使用,切不可久放。

    (4)恒温水浴上提取和显色时间要严格控制。

    (5)比色时的顺序要与加茚三酮试剂的顺序相同。