一、实验原理

植物样品中的IAA溶于含水的有机溶剂，在40℃以下减压蒸去有机溶剂后，IAA溶于水中。IAA是酸性化合物，在酸性条件下（pH2.8），可以用有机溶剂乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯减压蒸干后，永久甲醇溶解残留物（含IAA）。甲醇溶液中IAA和其他物质由于在液相色谱系统中流动相和固定相的分配系数的不同，从而出峰时间不同；因此，能够通过HPLC测定植物材料中的IAA含量。

二、实验步骤

1、IAA的提取

（1）称取黄化绿豆下胚轴2g为1份，共取2份，其中1份在步骤（2）用甲醇提取时，加入IAA100ng，用来计算回收率。材料用液氮冷冻后放入超低温冰箱，保存待用。

（2）每份材料加10mL预冷甲醇，100mgBTH，少许石英砂和PVP，快速研磨后，4℃下浸提24h，用4层纱布过滤，转移滤液到离心管中。残渣再用5mL80%甲醇（用重蒸水配制）浸提，合并滤液。

（3）滤液在4℃下，1000g离心20min，取上清液，沉淀用5mL80%甲醇洗一次，离心，合并上清液。

（4）40℃黑暗条件下，用旋转蒸发仪减压浓缩除去甲醇，得水相。

（5）水相用等体积三氯甲烷萃取3次，去除色素。

2、IAA的纯化

（1）用3mL100%甲醇洗Sep-Pak C18小柱，弃去流出液。

（2）用3mL70%甲醇缓慢流经小柱（平衡柱子），弃去流出液。

（3）加入5mL激素浸提液，使之缓慢流经柱子，收集流出液（即得去除亲脂色素的纯化液），在此步骤中，色素被柱子吸附，流出的液滴基本是无色的。

（4）用5mL100%甲醇洗柱，弃流出液。

（5）用5mL乙醚洗柱，弃流出液。

（6）用5mL70%甲醇洗柱（平衡柱子），弃流出液。

（7）从步骤（3）开始，重复步骤（4）~（6），纯化第2个激素样品。

（8）用1mol/L盐酸将得到的样品液pH调为2.8，加等体积水饱和的乙酸乙酯，用分液漏斗萃取3次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩至干，残留物用0.5mL甲醇溶解。用孔径为0.45μm的超微滤膜过滤后进行HPLC的分离和测定。

3.IAA含量测定

（1）HPLC测定条件
ODS C18反相柱，规格为5*4.6*25（柱子填充物的颗粒直径5μm，柱子内径4.6mm，柱长25cm）。洗脱液为甲醇和重蒸水，流速为0.8mL/min，梯度洗脱，0~4min，重蒸水为100%；第4~6min，甲醇为40%；第10~13min,甲醇变为60%；第20~25min，甲醇变为80%；第30~40min，甲醇变为100%；进样量为20μL，检测波长为254nm。用外标法定性，峰面积定量，重复测定3次。

（2）标准曲线的制作
用甲醇配制1、10、20、100、200、1000mg/mL的IAA系列溶液，分别进样，记录保留时间，以IAA的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标作图，计算出直线方程和相关系数。

（3）据IAA的标准曲线以及回收率，计算出材料中IAA的含量。

（4）回收率的计算

三、注意事项

萃取过程要注意分层效果，尽量不丢失所要的成分，又要将杂志去除干净。