目的要求

      了解叶绿素含量变化对水果、蔬菜采后品质的不同影响,掌握叶绿素测定原理和测定方法。

原理：

      叶绿素( chlorcphyl)是植物进行光合作用的重要色素物质。在水果、蔬菜中也大量存在着叶绿素。然而随着果蔬成熟哀老,叶绿素含量不断下降。水果在成熟哀老过程中,叶绿素分解后.可使其它种类色素如类胡萝卜素、花青素的颜色得以呈现。蔬菜在采摘后,叶绿素含量下降,出现萎蔫发黄,新鲜度明显降低，影响食月品质、加工性能和商品价值。

      叶绿素有叶绿素a和叶绿素b两种类型。叶绿素a、叶绿素b的内酮提取液在红光区波长663nm和645nm处分别具有最大吸收峰。在波长663nm处，叶绿素a、叶绿素b的80%丙酮提取液的吸光系数分别为82.04和9.27;在波长645nm处测分别为16.75和45.60。根据加和性原则，可得出叶绿素溶液在波长663nm和645nm处的吸光度Aw和Ao1s与叶绿素溶液中叶绿素a和叶绿素b的质量浓度pa和pb(以mg/L为单位)的关系,推导出Amon汁算公式。

      将pa与pb相加即得叶绿素总量P:

      此外，叶绿素a、叶绿素b在波长652nm处吸收峰相交,两者有相同的吸光系数,均为34.5。因此，叶绿素总量pτ还可在652um处测定:

      因此，根据叶绿素的丙酮提取液对可见光谱的吸收特性,利用分光光度计在相应波长处测定提取液的吸光度值,按照前面的公式就可以计算出提取液中叶绿素的含量。再根据果蔬样品质量和提取液的体积，可以计算出果蔬组织中叶绿素的含量。

材料、仪器及试剂

(一)材料

      蔬菜叶片，梨、苹果等果实圆片(用打孔器打取果实表皮,再用不锈钢刀切成1mm厚的薄片)。

(二)仪器及用具

      分光光度计、容量瓶( 100mL)、棕色容量瓶( 50mL)、移液器、研钵、电子天平、漏斗、定量滤纸、量筒( 100mL)。

(三)试剂

      1.石英砂
2.碳酸钙粉
3.80% (体积分数)丙酮溶液量取80mL丙酮(分析纯),加蒸馏水至100mL,混匀。

实验步骤

(一)提取

      (1)称取1.0g果蔬样品放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2~3mL80%丙酮溶液,研成匀浆,再加10mL80%丙酮溶液继续研磨至组织变白。静置3~5min提取。

      (2)取一张滤纸,折叠后置于漏斗中,用80%丙酮润湿,沿玻璃棒将提取液倒入漏斗中，过滤到50mL棕色容量瓶中,冲洗研钵、研棒和残渣数次,最后连同残渣--起倒人漏斗中，用丙酮溶液冲洗，直至滤纸和残渣中无绿色为止。

      (3)最后用80%丙酮溶液定容至50mL,摇匀。注意，各器皿、用具在使用之前必须用80%丙酮溶液润洗。

实验结果与计算

1.测定数据记录

      按前面的Aron公式计算得提取液中叶绿素a和叶绿素b的质量浓度,再按下式计算果蔬组织中叶绿素的含量,以每克果蔬组织鲜重中所含叶绿素的质量表示,即mg/g。计算公式:

式中 p一由公式计算得叶绿素的质量浓度,mg/L;
V一样品提取液总体积,mL;
m——样品质量,g。

注意事项

(1)为了避免叶绿素的分解,应在弱光和低温下操作,研磨时间尽量短些。提取过程应在闭光、低温下进行。
(2)提取干材料叶绿素时一-定要用80%丙酮溶液。但是由于一般果蔬组织含水量特别高,因此，对于新鲜的果蔬组织应用无水丙酮提取色素较好。
(3)叶绿素提取液不能混浊,必须利用定量滤纸过滤或进行高速低温离心。
(4)如果材料叶绿素含量较高时,可将提取液体积定容至100mL,或对提取液进行适当倍数的稀释后再测定。
(5)波长精度要求高,必要时应对分光光度计的波长进行校正。尽量使用高中档的仪器,如岛津UV-120、UV -240等。而低档型号分光光度计如722型、721型在测定叶绿素a、叶绿素b时,因仪器的狭缝较宽,分光性能较差,单色光的纯度低,会导致叶绿素a.的测定值偏低而叶绿素b的测定值偏高，a/b 严重偏小。