单糖组成分析是研究多糖结构、性质及构效关系的基础。其研究中主要包括多糖水解的方法和条件、衍生化方法和单糖检测方法,如图1所示。常用的水解方法主要有酸水解法和酶解法,此外还有氧化降解法、超声降解法、辐射降解法等。由于单糖不具有紫外与荧光吸收,检测时常将其进行衍生化处理。单糖组成最常用的检测方法一般有4种,分别是气相色谱法(GC)、高效液相色谱(HPLC)、离子色谱法 (IC) 和薄层色谱法(TLC)。
图1:多糖的单糖组成分析步骤与方法[1]
GC法-上海液质检测
GC法较早用于分析多糖单糖组成,方法灵敏度高,各单糖的色谱峰的分离度良好。由于单糖不具有挥发性,采用GC法测定时,常对单糖进行硅烷化或乙酸酯化处理,使其成为易挥发且对热稳定的衍生物。GC法只适合测定中性多糖,不适宜测定糖醛酸及N-乙酰氨基糖的检测[2]。GC法测定多糖的单糖组成,常用的检测器包括氢火焰检测器(FID)、质谱检测器 (MS)。
HPLC法-上海液质检测
HPLC法是测定多糖单糖组成的常用方法之一,较GC法更适用于单糖组成较为复杂的多糖检测。HPLC法常使用键合相硅胶柱(如C18柱)和氨基柱。目前基于离子交换、空间排阻、配位交换、分配吸附等多种分离原理的新型糖分析柱也日益应用广泛,如SugarS系列、SugarKS系列、AsahipakGS-220HQ、AsahipakNH2P系列色谱柱等。HPLC法检测单糖时,常用检测器主要有紫外检测器(VWD)、荧光检测器 (FLD)、示差折光检测器(RID)、蒸发光散色检测器(ELSD)、电喷雾检测器(CAD)、电化学检测器 (ECD)、二极管阵列检测器(DAD),各检测器特征比较如表1所示。根据所用检测器的不同,可分为衍生化后测定和直接测定2种情况。一是联用DAD、VWD或FLD时,水解后的单糖需衍生化处理才能被测定,实验室常用的衍生试剂如1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP) [3]。此法可检测酸性、中性和碱性多糖的单糖组成[4],但用于酮糖测定的衍生化法很少;二是联用RID、ELSD、ECD、CAD时,可无需对单糖进行衍生化。
表1:HPLC法联用的各检测器特征比较
图2:HPLC法单糖标准品图
IC法-上海液质检测
IC法是一种新型液相色谱技术,基于离子型化合物中的离子成分,可与离子柱表面的带电荷基团发生可逆性交换的原理,实现各化合物的分离。多糖水解后可直接通过IC法测定其单糖组成[5]。
图3:IC法单糖标准品图
TLC法-上海液质检测
使用TLC法测定单糖组成时,多糖水解后无需衍生化。TLC法常用薄层板为硅胶G板和微晶纤维素板、活性炭层析柱,常用展开剂和显色剂见图1。TLC法有操作方便、分离快速、设备简单等优点,但其对单糖的分离度低,实验条件如温度、湿度、操作者的实验水平等,对实验结果的影响较大,在灵敏度和准确度上低于HPLC法,常用作定性分析。
上海液质检测-糖类检测项目表
序号
项目
样品要求
测试方法
联系我们
1
糖类
总糖
1g干样/10g鲜样
GB/T 15672-2009 采用苯酚-硫酸比色法
2
1g干样/2g鲜样
蒽酮法
3
1g干样/2g鲜样
3,5-二硝基水杨酸比色法
4
1g干样/5g鲜样
蒽酮比色法
5
糖组分(DL-木糖、DL-木糖、蔗糖、鼠李糖、 阿拉伯糖、麦芽糖、棉子糖、D-半乳糖、甘露醇、海藻糖、D-山梨醇、D-果糖)
1g干样/5g鲜样
GB 5009.8-2016 以高效液相色谱-示差检测器检测所提取样品中糖含量(目前只接受水果类的糖组分测定)
6
1g干样/10g鲜样
① 采用苯酚-硫酸比色法(参考NY/T 1676-2008)
0.5g干样/4g鲜样
7
4g鲜样
NY/T 2637-2014 采用折光法
8
β-葡聚糖
0.2g干样
采用试剂盒测定
② 采用蒽酮硫酸比色法
③采用苯酚-硫酸比色法
✎ 参考文献
[1] 万晓莹,刘振丽,宋志前,等. 中药多糖定性鉴别与糖谱的研究进展.中国中医基础医学杂志,2021,27(5):876-881;
[2] 刘源才,孙细珍,许银,等.枸杞多糖组成及含量测定方法的改进.食品科学,2013, 34(12) :292-295;
[3] 付海宁,赵峡,于广利,等.盐藻多糖单糖组成分析的四种色谱方法比较.中国海洋药物, 2008,27(4):30-34;
[4] DENG Y, HAN BX, HU DJ, et al. Qualitation and quantification of water soluble non-starch polysaccharides from Pseudostellariaheterophylla in China using saccharidemapping and multiple chromatographic methods.Carbohydor Polym,2018,199: 619-627;
[5] 赵彪希,张海德, 张媚健等.冬虫夏草多糖单糖组成及免疫活性研究. 食品工业科技, 2020,41(13):27-31.
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