货号:UPLC-MS-4151 | 规格:100T/48S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4150 | 规格:50T/24S | 可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 100mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 40 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
液体 20 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
标准品 |
粉剂×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、试剂二:临用前加入 20mL 试剂一充分溶解备用;用不完的试剂 4℃保存;
2、标准品:10mg 葡萄糖,临用前加入 1mL 蒸馏水溶解,制备 10mg/mL 葡萄糖标准液备用。
蔗糖转化酶(Invertase,Ivr)催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 pH,将高等植物 Ivr 分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两种类型。NI 主要存在于细胞质中,负责分解细胞质中蔗糖为果糖和葡萄糖。
NI 催化蔗糖分解产生还原糖,进一步与 3,5-二硝基水杨酸反应,生成棕红色氨基化合物,在 540nm 有特征光吸收,在一定范围内 540nm 光吸收值与还原糖生成量成正比。通过光吸收增加速率来计算 NI 活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。12000g ,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 540nm,蒸馏水调零。
2、 标准品的制备:将标准液用蒸馏水稀释为 2、1.5、1.0、0.5、0.25、0mg/mL 葡萄糖标准液
3、 操作表(在 1.5mL EP 管中依次加入下列试剂)
试剂名称(μL) |
测定管 |
对照管 |
标准管 |
样本 |
50 |
50 |
- |
试剂一 |
|
200 |
- |
试剂二 |
200 |
|
200 |
标准液 |
- |
- |
50 |
混匀, 37℃准确水浴30min后,煮沸10min左右(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变),12000 g,4℃离心5min,取上清。 |
|||
上清 |
200 |
200 |
200 |
试剂三 |
125 |
125 |
125 |
混匀,煮沸 10min 左右(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀,取 200μL 至微量玻璃比色皿或 96
孔板中,540nm 处记录各管吸光值 A,ΔA=A 测定-A 对照。
1、标准曲线的建立:
以各浓度下吸光值减空白管(浓度为0mg/mL)的吸光度为y轴,葡萄糖浓度为x轴绘制标准曲线。根据标准曲线,将ΔA带入方程得到x(mg/mL)。
2、NI活性计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义:37℃每mg蛋白每分钟产生1µg还原糖定义为一个酶活性单位。
NI活性(U/mg prot)=(x×V1×1000)÷(V1×Cpr)÷T=33.3 ×x÷Cpr
(2) 按样本质量计算
单位定义:37℃每g组织每分钟产生1µg还原糖定义为一个酶活性单位。
NI活性(U/g 质量)=(x×V1×1000)÷(W×V1÷V2)÷T=33.3 ×x÷W
1000:单位换算系数,1 mg/mL =1000µg/mL;V1:加入反应体系中样本体积,0.05mL;V2:加入提取液体积,
1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间:30min。
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