亮氨酸氨基肽酶(LAP)活性检测试剂盒-亮氨酸氨基肽酶(LAP)试剂盒-上海液质



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货号:UPLC-MS-4465 规格:100T/96S 微量法
货号:UPLC-MS-4464 规格:50T/24S 可见分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

试剂一

液体 120 mL×1

4℃保存

试剂二

粉剂×1

4℃保存

溶液的配制:

试剂二:临用前加入 2.5 mL 丙酮溶解。

产品说明:

LAP是一种膜结合酶,广泛存在于肝、胆、胰等组织中,参与组织蛋白和某些肽类的降解更新。各类肝病患者因肝细胞损伤,血清LAP的活性均有不同程度的升高,LAP可以作为各类肝病的一项初步检测指标,特别是肝癌鉴别诊断的指标。

LAP分解L-亮氨酸对硝基苯胺生成对硝基苯胺,后者在405nm有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算LAP活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、丙酮、匀浆器/研钵、冰、蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆,然后,10000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

2、细胞或细菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL) 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3、液体:直接检测。

二、测定步骤

1 分光光度计/酶标仪预热30min以上,波长调至405nm,分光光度计蒸馏水调零。

2 加样表:在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入下列试剂

试剂名称(μL

测定管

空白管

试剂一

 

10

样本上清

10

 

试剂一

170

170


试剂二

20

20

在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入上述试剂,充分混匀后于405nm处测定30s时的吸光值A1,迅速置于37℃水浴3min(有控温功能的酶标仪可以将温度调至37℃),拿出迅速擦干测定210s时的吸光值A2,计ΔA测定管=A2测定-A1测定,ΔA空白管=A2空白-A1空白,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管空白管只需做1-2次)。

三、LAP酶活计算

A、按微量玻璃比色皿计算:

1、按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(V样×Cpr) ÷T=675.4×ΔA÷Cpr

2、按样本质量计算:

单位的定义:每g组织每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(U/g 质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(W× V样÷V样总) ÷T=675.4×ΔA÷W

3、按细胞数量计算:

单位的定义:每1万个细胞每分钟生成1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。LAP(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.35×ΔA

4、按液体体积计算:

单位的定义:每mL血液每分钟生成1nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(U/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷V样÷T=675.4×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:对硝基苯胺摩尔消光系数,9.87×103L/mol/cm;109:单位换算系数, 1mol=109nmol;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入试剂一体积,1mL;T:反应时间,3min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞总数,500万。

B、按96孔板计算:

将上述计算公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。

注意事项:

1、ΔA大于0.5时或者A值大于1.5时建议将样本上清用试剂一稀释后再进行测定。

2、空白管的ΔA变化小于0.01。


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