1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。

2、 操作表：酶促反应

37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应20min后，沸水浴5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10000g常温离心10min，取上清。

3、 定磷：

混匀，37℃水浴30min，冷却至室温，吸取200μL至微量玻璃比色皿或96孔板总，在 660nm处记录各管吸光值， 记为A标准管、A空白管、A测定管、A对照管，并计算ΔA标准=A标准管-A空白管，ΔA测定=A测定管-A对照管。（标准管、空白管只要做1-2次）

三、NADPase酶活性计算

1、 按组织蛋白浓度计算：

定义：规定每分钟每毫克组织蛋白的组织中NADPase分解NADP产生1μmol无机磷的量为一个NADPase活力单位。

NADPase (U/mg prot) =ΔA测定÷ΔA标准÷C标准×V上清÷（Cpr×V样本×V上清÷V酶促）÷T

=0.25×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

2、 按样本质量计算：

定义：规定每分钟每克组织中NADPase分解NADP产生1μmol无机磷的量为一个NADPase活力单位。

NADPase (U/g  质量) =ΔA测定÷ΔA标准÷C标准×V上清÷(W×V样本÷V提取×V上清÷V酶促)÷T

=0.25×ΔA测定÷ΔA标准÷W

C标准：1μmol/mL的磷标准应用液；V上清：定磷试验中上清液体积，0.02mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V 样本：酶促反应中样本体积，0.04mL；V酶促：酶促反应总体积，0.2mL；T：反应时间，20min；V提取：提取液体积，1mL；W：样本质量，g。

注意事项：

1、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格，要没有一点磷，若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液，一定要洗得非常干净，要先用洗洁精加水煮，再用自来水冲，最后用蒸馏水冲干净。最好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是检测成败的关键。

2、由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。