上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家，并承接生化代测，Elisa代测，HPLC 检测，GC检测，GC-MS 检测，LC-MS检测，ICP-MS检测 、土壤、植物、动物，成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购
货号：UPLC-MS-4286 规格：100T/96S 微量法
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试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
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提取液 |
液体 110 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
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粉剂一 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
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试剂一 |
液体 20 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
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试剂二 |
液体 3mL×1 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制：
1、提取液：临用前将粉剂一倒入提取液中，溶液为悬浊液，使用前需摇匀。
LOX 广泛存在于植物组织中，特别是黄豆种子中。LOX 催化不饱和脂肪酸氧化反应，导致膜脂过氧化。在植物的生长发育、成熟衰老及逆境胁迫过程中具有重要作用。
LOX 催化亚油酸氧化，氧化产物在 234nm 处有特征吸收峰；测定 234nm 吸光度增加速率，来计算 LOX 活性。
需自备的仪器和用品：
研钵/匀浆器、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可调式移液枪和蒸馏水。
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
称取约 0.1g 样本，加提取液 1mL，冰上充分研磨，16000g 4℃离心 20min，取上清液置冰上待测。
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 234nm，蒸馏水调零。
2. 试剂一在 25℃水浴中预热 30min 以上。
3. 空白管：依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入20μL 蒸馏水、160μL 试剂一和20μL 试剂二，迅速混匀后于234nm比色，记录 15s 和 75s 的吸光值，分别记为 A1 和 A2。空白管只需做 1-2 次
4. 测定管：依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入20μL 上清液、160μL 试剂一和20μL 试剂二，迅速混匀后于234nm比色，记录 15s 和 75s 的吸光值，分别记为 A3 和 A4。
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1. 按蛋白浓度计算
活性单位定义：在 1mL 体系下，25℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化 0.001 个单位为一个酶活单位。LOX (U/mg prot) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷0.001÷(Cpr×V 样)÷T×V 反总=10000×[(A4-A3)-(A2-A1)]÷Cpr
2. 按样本质量计算
活性单位定义：在 1mL 体系下，25℃中每克样本每分钟催化吸光值变化 0.001 个单位为一个酶活单位。LOX (U/g 质量) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷0.001÷(V 样÷V 样总×W)÷T×V 反总=10000×[(A4-A3)-(A2-A1)]÷W
Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL（需另外测定）；W：样本质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，
20μL=0.02mL；V 样总：上清液总体积，1mL；T：反应时间，1min；V 反总：反应总体系，0.2mL。
3. 按蛋白浓度计算
活性单位定义：在 1mL 体系下，25℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化 0.0006 个单位为一个酶活单位。LOX (U/mg prot) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷0.0006÷(Cpr×V 样)÷T×V 反总=16667×[(A4-A3)-(A2-A1)]÷Cpr
4. 按样本质量计算
活性单位定义：在 1mL 体系下，25℃中每克样本每分钟催化吸光值变化 0.0006 个单位为一个酶活单位。LOX (U/g 质量) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷0.0006÷(V 样÷V 样总×W)÷T×V 反总=16667×[(A4-A3)-(A2-A1)]÷W
Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL（需另外测定）；W：样本质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，
20μL=0.02mL；V 样总：上清液总体积，1mL；T：反应时间，1min；V 反总：反应体系总体积，0.2mL。
1. 样本处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日完成酶活性测定。
2．正式实验前做 1~2 个预实验，保证∆A 的值在 0.02~1.2（微量石英比色皿）/0.01~0.72（96 孔板）范围内；若反应后为明显的悬浊液，则需稀释后再测。
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