果蔬中可溶性糖可分为还原糖(包括各种单糖和麦芽糖)和非还原糖(主要是蔗糖)。还原糖具有醛基和酮基,主要来源于多糖类物质和其它一些大分子的降解产物。同时,这些还原糖还能为淀粉、纤维素、果胶质等大分子碳水化合物和核苷酸等多种物质的合成提供糖基供体，与果蔬的生理生化代谢密切相关。

       在测定果蔬组织中的多种碳水化合物如总糖淀粉、纤维素,多种酶如淀粉酶纤维素.酶、果胶酶和葡聚糖酶、糖苷酶时,都需要通过测定还原糖含量的方法测定这些物质的含量或酶的活性。因此,还原糖含量的测定方法在研究果蔬生理生化代谢中具有重要意义。常用的测定果蔬中还原糖的化学方法有3,5-二硝基水杨酸法、斐林氏法、碘量法、高锰酸钾法、铁氰化钾法等。

3 ,5-二硝基水杨酸法

目的要求

       熟练掌握3 ,5 -二硝基水杨酸法测定果蔬组织中还原糖的原理和方法。

基本原理

      3 ,5 -二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸化合物。在一定范围内,还原糖的量和棕红色深浅的程度成一定比例关系。因此,可在540nm波长下通过测定棕红色物质的吸光度值计算样品中还原糖的含量。

材料、仪器及试剂

(一)材料

      各种果蔬组织。

(二)仪器及用具

       点子天平、分光光度汁、刻度试管(25mL)、漏斗、滤纸、研钵、烧杯( 1 000mL、100mL)、三角瓶、容量瓶( 1 000mL、100mL)、刻度吸管(或移液器)、水浴锅。

(三)试剂

1、1mg/mL 葡萄糖标准液
准确称取100mg分析纯葡萄糖(预先在80°C烘至恒重) ,置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后,转移到100mL的容量瓶中,以蒸馏水定容至刻度,摇匀,冰箱中保存备用。

2、3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂
(1)配制500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液;
(2)配制262mL的2mol/L NaOH溶液;
(3) 称取6.3g的3,5 -二硝基水杨酸;
(4)称取5.0g结晶酚;
(5)称取5.0g亚硫酸钠;
(6)将(2)、(3)、(4)、(5)各成分加人到(1)中，搅拌， 使之溶解。待冷却后,转入到1000mL容量瓶中,并用蒸馏水定容至刻度，贮于棕色瓶中备用。盖紧瓶塞，勿使CO,进人。若溶液混浊可过滤后使用。

实验步骤

(一)制作葡萄糖标准曲线

      取7支具塞刻度试管，编号,按表5所示的量，精确加入1g/L葡萄糖标准液和3,5-二硝基水杨酸试剂。

      将各管摇匀,在沸水浴中加热5min,取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温,再以蒸馏水定容至25mL刻度处，混匀。在540nm波长下,用0号管作为参比调零，测定显色液的吸光度值。以吸光度值为纵坐标,葡萄糖质量为横坐标,绘制标准曲线,求得线性回归方程。

(二)还原糖的提取

      准确称取1. 0g果实组织置于研钵中,加入少量蒸馏水，研磨匀浆后转入到25mL刻度试管中,冲洗研钵,一-并转入到试管中,补加蒸馏水至25mL刻度处,在80°C恒温水浴中保温30min,使还原糖浸出。取出冷却后,过滤浸提液,用20mL蒸馏水洗涤残渣，再过滤。将两次滤液全部收集在100mL的容量瓶中,定容至刻度，混匀,作为还原糖提取液备用。

(三)显色和比色

       取25mL刻度试管,分别加入2. 0mL还原糖提取液和1. 5mL3,5-二硝基水杨酸试剂,按照与制作标准曲线相同的方法操作,测定各管中溶液的吸光度值。重复三次。如果吸光度值读数过高,就要对提取液进行稀释后测定。

实验结果与计算

1.测定数据记录

2.计算结果

      根据显色液吸光度值,在标准曲线上查出相应的葡萄糖质量，按下式计算果蔬组织中还原糖含量,以质量分数(% )表示。计算公式:

式中 m′——从标准曲线查得的葡萄糖质量,mg;
V——样品提取液总体积, mL;
N——样品提取液稀释倍数;
VS——测定时所取样品提取液体积, mL;
m——样品质量,g。

注意事项

      (1)配制3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS),在将含DNS的NaOH溶液加到含酒石酸钾钠的热水溶液中时,一定要慢慢倒人，边倒边搅拌,以防被烫伤。

      (2)测定波长问题。在还原糖提取液中,带还原性基团(醛基)的糖多种多样(如葡萄糖、麦芽糖、半乳糖醛酸等都带有还原性基团) ,在利用3,5 -二硝基水杨酸法测定时形成的呈色化合物最大吸收峰可能会发生不同程度的变化。一般波长变化范围为500~540nm。在具体测定时,可在波长500nm、510nm. 520nm和540nm等处进行预实验,了解最大吸收峰所在的波长,以便获得较好实验结果。

      (3)标准曲线问题。一般用葡萄糖作为还原糖计算各种还原糖的含量,在具体测定某种还原糖时,可以利用该还原糖制作相应的标准曲线。