抗坏血酸( ascorbic acid , ASA) ,即还原型维生素C,是人类营养中最重要的维生素之人体缺乏抗坏血酸时容易出现坏血病。近年来,研究还发现抗坏血酸可增强机体对肿瘤的抵抗能力,并对化学致癌具有阻断作用。维生素C是一种已糖醛酸,主要分为还原型和脱氢型两种,广泛存在于植物组织中,新鲜的水果、蔬菜，特别是枣辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等果蔬中含量较多。果蔬中抗坏血酸含量受果蔬种类、品种、栽培条件、成熟度和贮藏条件等的影响。测定维生素C含量，可以作为果蔬的营养品质和贮藏效果的评价指标之一。

2,6-二氯酚靛酚滴定法

目的要求

      了解测定果蔬组织中抗坏血酸含量的意义,掌握利用2,6-二氯酚靛酚滴定法测定抗坏血酸含量的原理和方法。

基本原理

       抗坏血酸是具有L系糖构型的不饱和多羟基化合物,分子中存在烯醇式结构，因而具有很强的还原性。染料2 ,6-二氯酚靛酚(2 ,6 - dichlorophenol indophenol) 具有较强的氧化性,且在酸性溶液中呈红色,在中性或碱性溶液中呈蓝色。还原型抗坏血酸能将2,6-二氯酚靛酚还原，同时自身被氧化为脱氢型抗坏血酸。因此，当用蓝色的碱性2,6-二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的草酸溶液时,2,6-二氯酚靛酚可被抗坏血酸还原成无色的还原型化合物,同时抗坏血酸也被氧化成脱氢型。当溶液中的抗坏血酸完全被氧化时,则滴下的染料立即使草酸溶液呈现浅粉红色。这一颜色转变,可以指示滴定终点。根据滴定时用去的标准2,6-二氯酚靛酚溶液的量,就可计算出被测样品中抗坏血酸的含量。

材料、仪器及试剂

(一)材料

      鲜枣、青椒、山楂、苹果、柑橘、芒果等。

(二)仪器及用具

      碱式滴定管(20mL)、容量瓶( 1000mL、500mL、100mL)、移液器、三角瓶( 100mL)、研钵、电子天平、漏斗、滤纸、铁架台、漏斗架。

(三)试剂

1、20g/L草酸溶液
称取20.0g草酸,用蒸馏水溶解,并稀释至1000mL。

2、0.1mg/mL标准抗坏血酸溶液
称取50.0mg抗坏血酸(应为洁白色,如变为黄色则不能用),用20g/L草酸溶液溶解,定容至500mL,即1mL溶液含0.1mg抗坏血酸。现用现配,贮于棕色瓶中，低温保存。

3、2,6-二氯酚靛酚溶液
称取100mg2,6-二氯酚靛酚钠盐,溶于100mL含有26mg碳酸氢钠的沸水中,充分摇溶(或冷却后置于冰箱中过夜),过滤,加蒸馏水稀释至1000mL。此溶液应贮于棕色瓶中放人冰箱保存。每周重新配制,临用前用标准抗坏血酸溶液标定。

      2 ,6-二氯酚靛酚溶液的标定:取10. 0mL标准抗坏血酸溶液于锥形瓶中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至微红色,15s不褪色即为终点,根据消耗的2,6-二氯酚靛酚溶液的量计算出每1mL染料溶液相当的抗坏血酸质量(重复三次,取平均值)。

实验步骤

(一)提取

      称取10.0g果蔬样品置于研钵中，加入少量20g/L草酸溶液,在冰浴条件下研磨成浆状，转人到100mL容量瓶中,用20g/L草酸溶液冲洗研钵后,亦倒入容量瓶中,再用20g/L草酸溶液定容至刻度,摇匀,提取10min后，过滤收集溶液备用。

(二)滴定

      用移液器吸取10.0mL滤液置于100mL的三角瓶中,用已标定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至出现微红色、且15s不褪色为止,记下染料的用量。同时，以10mL 20g/L草酸溶液作为空白,按同样方法进行滴定。重复三次。

实验结果与计算

1.测定数据记录

2.计算结果

      根据染料的滴定消耗量,计算果蔬中抗坏血酸含量,以100g样品(鲜重)中含有的抗坏血酸的质量表示,即mg/100g。计算公式:

式中 V——样品滴定消耗的染料体积,mL;
Vo——空白滴定消耗的染料体积,mL;
p——1mL染料溶液相当于抗坏血酸的质量,mg/mL;
VS——滴定时所取样品溶液体积，mL;
V——样品提取液总体积, mL;
m——样品质量,g。

注意事项

      所有试剂最好用重蒸馏水配制。蛋白质含量较多的样品可用10%三氯乙酸代替20g/L草酸溶液提取;对含有大量铁离子的样品，如储藏过久的罐头食品可用8%乙酸溶液代替草酸溶液提取。测定样品溶液时必须同时做空白对照,要扣除空白滴定的影响。

      某些果蔬(如橘子、西红柿)浆状物泡沫太多,可加数滴丁醇或辛醇以消除泡沫。提取的浆状物如不易过滤,亦可通过离心,取上清液测定。此外，若提取液中色素较多时,滴定不易看出颜色变化,可用白陶土脱色,或加1mL氯仿,到达滴定终点时,氯仿层呈现淡红色。

      整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化，滴定过程一般不超过2min。滴定所用的染料不应小于1mL或多于4mL。如果样品抗坏血酸含量太高或太低时,可增减样品液用量或改变提取液稀释度。也可以考虑将染料适当稀释并重新标定。在滴定开始时,染料溶液要迅速加入,直至红色不立即消失,然后尽可能一滴一滴地加人，并要不断振动锥形瓶，直至呈粉红色，且于15s内不消失为止。样品中可能有其他杂质也能还原2,6-二氯靛酚,但一般杂质还原该染料的速度均较抗坏血酸慢,所以滴定时以15s内红色不褪为终点。