本文介绍了酶联免疫吸附检测法(ELISA)测定植物激素含量的测定方法，包括酶联免疫吸附检测法的原理，实验所需试剂，实验步骤以及实验注意事项。

原理：

      植物激素（plant hormone）免疫定量主要有放射免疫分析（RIA）和酶联吸附免疫分析（ELISA），由于前者操作上欠安全等原因,目前常采用后一种类型。在ELISA中,抗原抗体反应的检测依靠酶标记物来实现,常用的酶有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酯酶。酶可直接标记激素分子,称为酶标植物激素,也可标记于第二抗体(识别抗激素抗体Fc片段的抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白),称为酶标二抗。这两类标记物分别用于周相抗体型和固相抗原型ELISA。

      A.固相抗体型ELISA:将抗激素的单克隆抗体(MAb)与已吸附于固相载体上的兔抗鼠lg抗体(RAMIG)结合，然后加人激素标准品或待测样品,使其与固相化的MAb结合,再加人辣根过氧化物酶(HRP)标记激素(酶标激素)。通过测定酶标激素的被结合量,可换算出未知样品中澈素的数量。

      B.固相抗原型FELISA:将“激素-蛋白”复合物(该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白)包被于周相载体,加入待测激素(样品或标准品)和抗IAA多克隆抗体(PAb)反应,进行竞争反应,然后让HRP标记羊抗兔lg抗体(HRP-GARIG)与结合在固相上的PAb反应,通过测定与固相结合的酶量，换算出未知样品中激素的含量。

材料、仪器设备及试剂

(一)材料

      高等植物、真菌、藻类等组织或器官。

(二)仪器设备

       酶联免疫检测仪,高速冷冻离心机,恒温箱,连续进样器,涡旋仪,96孔微孔板,离心管，研钵或匀浆器,试管。

(三)试剂

      (1)洗涤缓冲液:0.01 mol/LpH 7.4磷酸缓冲液(PBS),含0.05% Tween-20。

      (2)RAMIG溶液,或“激素-蛋白”复合物。

      (3)0.1%封闭蛋白(该蛋白应不同于免疫原中的载休蛋白)。

      (4)抗激素MAb,或PAb。

      (5)激素标准品母液及参比系列溶液(按双倍或四倍系列稀释)。

      (6)HRP标记激素,或HRP-GARIG。

      (7)领苯二胺（OPD）基质液：5mgOPD溶于12.5mL0.01mol/LpH5.0PBS，用前加入30%H2O212.5μL。

实验步骤

(一)固相抗体型ELISA

      (1)用方阵法滴定选择各反应物最适工作浓度。

      (2)将100 μL RAMIG溶液包被聚苯乙烯反应板微孔,4℃湿盒,12 h。

      (3)弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干。

      (4)加人100μL抗激素MAb溶液,37℃70min。

      (5)弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩于。

      (6)各孔内依次加人50 μL待测样液,每个样品3次重复,15-20℃,20 min。

      (7)加人50山HRP标记激素,37℃,60min。

      (8)弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干。

      (9)加人100 μL OPD基质液,37℃显色15-20 min,加人50 μL 3mol/L H2SO4中止反应。用酶联免疫检测仪测定490nm下各孔的A490值,求出每份样品重复孔的平均值。

      (10)用激素标准品母液和参比系列溶液,在同一微孔板上同上法操作。(

(二)固相抗原型ELISA

      (1)用方阵法滴定选择各反应物最适工作浓度。

      (2)将100μL“激素-蛋白”复合物溶液包被于微孔板,37℃, 12h。

      (3)弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次甩干。

      (4)加人100μL,0.1%封闭蛋白溶液封闭,37℃30min。

      (5)弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干。

      (6)各孔同时加入50μL样液和50μL抗激素PAb溶液,以加人正常兔血清溶液的孔(非特异吸附孔)为空白调零,37℃,60min。

      (7)弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干。

      (8)加入100 μL HRP - GARIG溶液,37℃,60 min。

      (9)弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干。

      (10)随后的显色、中止与比色程序同上。

      (11)用激素标准品母液和参比系列溶液,在同一徼孔板上同上法操作。

计算结果

(一)固相抗体型ELISA

      (1)以加人激素母液的孔(非特异吸附孔)为空白调零,以加人不含激素的PBS的孔为B0孔,以加人激素标准参比系列溶液的各孔为Bt孔。以标准激系摩尔数的常用对数log[激素]为横坐标(x),对应的In[ Bt/(B0 - Bt)]为纵坐标(y),可得一条y=a+ bx直线。

      (2)将样品孔的A490值代人上式,换算出待测样品中激素摩尔数量,乘以稀释倍数,除以样品重量,即为每克样品的激素含量。

(二)固相抗原型ELISA

      以加人不含激素的磷酸缓冲液的孔为B0孔,以加人激素标准参比系列溶液的各孔为Bt孔。标准曲线计算与结果分析同上。