一、范围

本方法适用于大豆只水溶性蛋白含量的测定。

二、原理

用水提取大豆中的水溶性蛋白，硫酸使含氮物转化成为硫酸铵，加强碱蒸馏使氨溢出，用硼酸吸收后，用标准盐酸滴定计算含氮量，乘以换算系数，计算出大豆中水溶性蛋白的含量。

三、试剂

除非另有说明，在分析中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或想当纯度的水。

（1）硫酸。

（2）盐酸。

（3）20g/L硼酸溶液：称取100g硼酸溶于5000mL水中。

（4）400g/L氢氧化钠溶液：称取2000g氢氧化钠溶于5000mL水中。

标定：精确称取经270℃~300℃干燥恒重过的基准碳酸钠约0.15g，加水50mL溶解，加甲基红溴甲酚绿混合指示剂10滴，液滴定到溶液由绿色变为紫色。煮沸2min，冷却至室温，继续滴定到溶液由绿色变为暗紫色，同时做空白实验。

盐酸标准溶液的浓度按下式计算。

式中：m——无水碳酸钠的质量，g；

V1——盐酸溶液用量，mL;

V2——空白试验盐酸溶液用量，mL;

0.0530——碳酸钠（Na2CO2）的毫克当量。

（6）混合指示剂：

1.0g/L甲基红乙醇溶液：称取0.1g甲基红溶于100mL乙醇中；

5.0g/L溴甲酚绿乙醇溶液：称取0.5g溴甲酚绿溶于100mL乙醇中。

两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3个月。

（7）混合催化剂（CuSO4+K2SO4=10+100）：称取10g硫酸铜（CuSO4+K2SO4·5H20）和100g硫酸钾（K2SO4），混匀，研磨，过∅0.42mm筛。

四、仪器设备

（1）采用凯氏定氨法为原理的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪，或常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式凯氏蒸馏装置。

（2）分析天平:感量0.001g。

（3）粉碎机。

（4）可控温往复式摇床:频率150次/min,全振幅60 mm, 20°C土2°C温度可控。

（5）消煮炉。

（6）离心机。

（7）快速滤纸。

五、操作步骤

粉碎机粉碎样品,过∅0.25 mm筛。称取粉碎试样5g，精确至0.01g，于50mL离心管中。吸取50mL20°C蒸馏水于离心管中，振摇使试样不结块，均匀分散。将离心管固定于摇床，温度控制在20°C士2°C,振荡60 min。取下离心管，以2000r/min离心10min。取出离心管，将上清液倒人250 mL容量瓶中。向离心管残渣中重新加人50mL 20°C蒸馏水,同前再振荡60min,离心10min,将上清液倒入容量瓶中。

重复操作两次，将提取液全部收集倒人容量瓶中，加蒸馏水定容至250mL。将容量瓶中溶液混合均匀后，快速滤纸过滤至250mL锥形瓶中，弃去最初的10mL~15mL滤液。准确吸取10mL提取液于500mL蒸馏管中，加入2g~3g混合催化剂,10mL硫酸，充分混匀。将蒸馏管置于通风橱中加热消化。开始用100C低温加热0.5h,至黑泡沫消失,控制瓶中泡沫不超过瓶管的三分之二,然后再升温至400°C~430°C，加热1.5h,至消化液呈透明的蓝绿色时，继续加热0.5h。

待消化液冷至室温，上机蒸馏滴定或采用常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式凯氏蒸馏装置蒸馏、滴定。

六、仪器参考条件

设定硼酸吸收滴定模式，加20mL水、70mL氢氧化钠溶液，加50mL硼酸溶液，蒸馏滴定总时间220s，150s后开始滴定，输入滴定标准盐酸溶液浓度。

七、结果计算

水溶性蛋白含量用质量分数w表示,单位以%计,按下式计算:

式中：V1——滴定样品消化液所耗盐酸标准溶液的体积，mL；

V0——-滴定空白消化液所耗盐酸标准溶液的体积，mL；

c——盐酸标准溶液的浓度，mol/L；

0.0140——氮的毫克当量数；

6.25——大豆含氮量换算成蛋白质系数；

m——试样的质量，g；

X——试样水分含量，以质量分数表示，%。

计算结果表示到小数点后一位。

八、精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术水平值的2%。

参考资料

NY/T 1205-2006 大豆水溶性蛋白含量的测定