过氧化氢酶（catalase，CAT）普遍存在于植物组织中，是重要的保护酶之一，其作用是清除代谢中产生的H2O2，以避免H2O2积累对细胞的氧化破坏作用，因而其活性的高低与植物的抗逆性有关。本文将会介绍两种测定过氧化氢酶活性测定的方法，即紫外吸收法和碘量滴定法的原理、实验步骤和注意事项。

1.紫外吸收法

1.1.原理

    H2O2对240nm波长的紫外光具有强吸收作用，CAT能催化H2O2分解成H2O和O2，因此在反应体系中加入CAT时会使反应液的吸光度（A240）随反应时间降低，根据A240的变化速率可计算出CAT的活性。

1.2.试剂

（1）50 mmol·L-1磷酸缓冲液（pH7.0）.
（2）200 mmol·L-1 H2O和O2溶液：30%H2O和O2 11.36ml溶于磷酸缓冲液中，定量至250mL.
（3）50 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液（pH7.0）.

1.3.方法步骤

（1）酶液的提取：称剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.00g置于预冷的研钵中，加适量磷酸缓冲液及少量石英砂，在冰浴上研磨匀浆，转移至10 ml量瓶中，用磷酸缓冲液冲洗研钵2-3次（每次1-2ml），合并冲洗液于量瓶中，定容至10ml，摇匀。取提取液5ml于离心管中，在4℃、15000g下离心15min，上清液即为酶提取液，4℃下保存备用。

（2）CAT酶活性测定：
①取10ml 具塞试管，加2ml酶提取液于沸水浴中加热煮死，冷却备用。
②取10ml 试管4支，3支为测定（3个重复），1支为对照，按下表加入试剂：

③将上述4支试管于25℃水浴中预热3min后，逐管加入0.2ml 200 mmol·L-1 H2O2溶液，每加一管立即在紫外分光光度计上测定A240(蒸馏水调零），每隔30s读数一次，共测3min，记录4支试管的测定值。

（3）结果计算：以1 min内A240降低0.1（3支测定管的平均值）为一个酶活性单位（U），先求出3支测定管各自1min内A240降低值，按下式计算CAT活性。

    式中，△A240=As0-(As1+As2+As3)/3;As0:煮死酶液对照管吸光度；As1、As2、As3：样品测定管吸光度；Vt：酶提取液总体积(ml);Vs:测定时取酶液的体积（ml）；FW：样品鲜重（g）

2.碘滴定法

2.1.原理

    CAT能催化H2O2分解成H2O和O2，其活性大小以一定时间内分解H2O2的量来表示。当反应体系中有过量H2O2存在时，酶与底物（H2O2）反应结束后，用碘量滴定法测定剩余的H2O2。其测定原理是：在钼酸铵催化下，H2O2与KI反应，放出游离I2，然后用Na2S2O3滴定碘。

    根据空白和测定二者滴定差值，即可计算出酶催化分解H2O2的量

2.2.试剂

(1)1.8 mol•L-1 H2S04:100 mL浓H2S04在搅拌条件下缓慢加入到500mL蒸馏水中，冷却后定容至1000mL。
(2)10%钼酸铵溶液：10g钼酸铵溶于蒸馏水中，定容至100mL。
(3)1%淀粉溶液：称取1g可溶性淀粉，于小烧杯中用20mL水调匀，缓慢加入80mL沸水中，搅拌下加热至沸腾，冷却后贮于滴瓶中。
(4)0.05 mol•L-1硫代硫酸钠（Na2S2O3)溶液：称取Na2S2O3•5H20 25 g,溶于新沸腾并冷却的蒸馏水中，加入约0.1 g Na2C03,溶解后定容至1000mL,贮于棕色试剂瓶中，置于暗处，1d后进行标定。
        标定方法：精确称取K2Cr207(分析纯）0.1500 g于500 mL三角瓶中，加30 mL蒸馏水溶解，加2g KI和5mL 6 mol•L-1 HCl，暗中放置5 min后用蒸馏水定量至200 mL,用上述 0.05 mol•L-1的Na2S2O3溶液滴定，当溶液由棕红色转变至淡黄色时加入1 mL 1%淀粉溶液, 继续滴定至溶液由蓝色变为亮绿色(Cr离子的颜色〉为止，计算出Na2S2O3溶液的确切浓度。
(5)0.01 mol•L-1 Na2S2O3溶液：用上述标定过的Na2S2O3溶液稀释而成，用时现配。
(6)0.2% H2O2溶液：取1 mL30%H2O2用蒸馏水稀释至150 mL,用Na2S2O3溶液标定。
(7)20% KI
(8)CaCO3

2.3.方法步骤

（1）酶液的提取：称取剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.0 g置于研钵中，加0.2 g CaCO3粉 末和2 mL蒸馏水研磨匀浆，移入量瓶中定容至100 mL，摇匀，静置，取上清液10 mL移入100 mL 量瓶中，蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。
（2）CAT活性测定：取100 mL三角瓶6个，编号，向各瓶中各加入稀释后的酶液10 mL，同时给4、5、6号瓶中各加5 mL 1.8 mol•L-1 H2SO4，终止酶活性，作为空白对照。将6个三角瓶置于20 ℃恒温水浴中保温5min,向各瓶中准确加入5 mL 0. 2 mol•L-1 H2O2溶液，记录加入的时间，摇匀后20℃水浴中保温，让酶作用5min后，依次向1、2、3号瓶中各加5 ml 1.8 mol•L-1 H2SO4终止酶活性。然后向各瓶中加1mL20% KI，3滴钼酸铵溶液及5滴1%淀粉指示剂，用 0.01 mol•L-1 Na2S2O3标准溶液滴定至蓝色消失，记录滴定数据。

2.4.结果计算

    反应过程中被分解的H2O2的量Q（mg）：
Q=[空白滴定值（mL）-样品滴定值（mL）]×Na2S2O3浓度（0.01 mol/L）×1.7

    式中，Vt：酶液总体积(mL);Vs:测定时取用酶液的量（mL）;FW：样品鲜重（g）；t：酶作用的时间（min）；1.7：消耗1mL 0.01mol·L-1 Na2S2O3标准溶液相当于1.7mg H2O2

2.5.注意事项

（1）凡对240nm波长的光有较强吸收的物质对本实验均有影响，避免之。
（2）当室温超过20℃时，反应温度以室温为准。
（3）紫外分光光度法进行比色测定时，要尽可能测定反应的初速度，因此H2O2溶液加入后应立即进行比色读数。